ISOLASI DNA TANAMAN dan ELEKTROFORESIS DNA

ISOLASI DNA TANAMAN dan ELEKTROFORESIS DNA

BAB I

PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon.

            DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom.         DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih, karena memiliki nukleus dimana terdapat DNA didalamnya.

DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontamoinasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder  seperti tannin, pigmen, alkaloid, dan flavonoid. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat, dan pada beberapa tanaman kontaminasi sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi diatas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitive oleh enzim retriksi dsan mengganggu proses amplifikasi DNA dengan PCR.

            Elektroforesis dengan Agarose merupakan metode standar untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/RNA. Cara pemisahan dengan elektroforesisi ini merupakan alat pendukung yang sangat pokok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA.

1.2  Tujuan

1. Dapat melakukan isolasi DNA dari berbagai jenis tanaman
2. Dapat memahami cara kerja senyawa yang digunakan untuk mengisolasi DNA

1.3  Dasar Teori

Isolasi DNA

Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya (Suryo 2004: 57).

Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen danintergen(Campbell dkk.2004:221).

DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti sel, sedangkan DNA prokariot terletak dalam sitoplasma (Jusuf  2001:7).

Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan Francis Crick. Mereka memperoleh model DNA dari hasil foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Watson dan Crick menyimpulkan bahwa struktur DNA merupakan rantai ganda (double helix). Untai ganda tersusun dari dua rantai polinukelotida yang terpilin. Kedua rantai memiliki susunan antiparalel, yaitu satu rantai berorientasi dari ujung 5’ ke 3’sedangkan yang lain berorientasi ujung 3’ ke 5’. Ujung 5’ merupakan ujung yang berakhir dengan gugus 5-fosfat dan ujung 3’ berakhir dengan gugus OH. Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang memghubungkan kedua basa nitrogen (Sadava dkk.2004:218--220).

Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen. Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dansitosin (Sadava dkk.2004:219).

DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal tersebut dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel makhluk hidup. Fungsi-fungsi tersebut adalah:

1. Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup (Sadava dkk.2004:220).
2. Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu fungsi DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri (Suryo 1999:59).

           DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat ditemukan pada mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas menunjukkan sifat berbentuk sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi semikonservatif, dan bebas dari protein histon. DNA kloroplas penting dalam proses fotosintesis (Raven & Johnson 2002: 94). DNA juga dijumpai pada organisme prokariotik. DNA prokariot mempunyai DNA ekstranuklear yang dinamakan plasmid. Plasmid merupakan DNA yang tidak terlalu esensial bagi fungsi kehidupan bakteri, tetapi penting dalam pengaturan siklus hidup dan perumbuhan dalam lokasi hidupnya.

Kebanyakan plasmid adalah sirkular dan tersusun dari beberapa ribu pasangan basa. Plasmid mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi dimulai dari titik ori hingga semua plasmid tereplikasi (Pierce2005:203).

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.

Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002: 115). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Alberts dkk. 1994: 254).

Sebuah difenilamin (DPA) indikator akan mengkonfirmasi keberadaan DNA. Prosedur ini melibatkan hidrolisis kimia DNA: ketika dipanaskan (misalnya ≥ 95 ° C) dalam asam, reaksi memerlukan gula deoksiribosa dan karena itu spesifik untuk DNA. Dengan kondisi tersebut, 2-deoksiribosa akan dikonversi ke w-hydroxylevulinyl aldehida, yang bereaksi dengan senyawa, difenilamin, untuk menghasilkan senyawa berwarna biru. Konsentrasi DNA dapat ditentukan mengukur intensitas absorbansi larutan pada 600 nm dengan spektrofotometer dan membandingkan dengan kurva standar konsentrasi DNA diketahui. Mengukur intensitas absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm digunakan sebagai ukuran kemurnian DNA. DNA menyerap sinar UV pada 260 dan 280 nanometer, dan protein aromatik menyerap sinar UV pada 280 nm, sebuah sampel DNA murni memiliki rasio 260/280 pada 1,8 dan relatif bebas dari kontaminasi protein. Sebuah persiapan DNA yang terkontaminasi dengan protein akan memiliki rasio 260/280 lebih rendah dari 1,8.

DNA bisa diukur dengan memotong DNA dengan enzim restriksi, menjalankannya pada gel agarosa, pewarnaan dengan bromida etidium atau noda yang berbeda dan membandingkan intensitas DNA dengan penanda DNA konsentrasi dikenal.
Menggunakan teknik Southern blot ini diukur DNA dapat diisolasi dan diperiksa lebih lanjut menggunakan analisis PCR dan RFLP. Prosedur ini memungkinkan diferensiasi diulang dalam urutan genom. Ini adalah teknik-teknik yang ilmuwan forensik digunakan untuk perbandingan, identifikasi, dan analisis.

Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.
Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia. KIRSMAN83.2010.isolasi DNA

Elektroforesis

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. ^[2] Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

Keterangan: F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA

Pita DNA Setelah Elektroforesis dan Diamati di Bawah Sinar UV

Jenis Elektroforesis

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.

Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.

1.4  Metode Kerja

Isolasi DNA Tanaman

Alat :

• mikrovivet berbagai ukuran
• tabung 1,5 ml
• tips mikropipet berbagai ukuran
• saringan
• gelas kimia
• sendok
• penangas
• vorteks
• mini sentrifuga
• blender / lumping

Bahan :

• buffer ekstraksi (100 mM tris- HCl, Ph 8; 50 mM EDTA; 500 mM NaCl, CTAB 2%)
• Potasium asetat 5 M
• SDS 20%
• Kloroform : Isoamil alcohol (24:1)
• Alkohol 100% (pa)
• TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8)
• Buah strowberi
• CTAB 2%

Elektoforesis DNA

Range pemisahan molekul DNA dengan agarose gel

Agarose %	Seaparsi optimal dari molekul DNA (Kb)
0,3	5,0-60
0,6	1,0-20
0,7	0,8-10
0,9	0,5-7,0
1,2	0,4-6,0
1,5	0,2-4,0
2,0	0,1-3,0

Bahan kimia :

• Buffer TAE 10 X (400 mM Tris asetat, 10 mM EDTA Ph 8 )
• Eidium bromida
• Loading buffer
• DNA Marker
• Agarose

Alat dan bahan :

• Elektroforesis unit (meliputi comb dan tray)
• Power suply
• Mikropipet digital
• Transilluminator UV

BAB II

HASIL PENGAMATAN

Tabel 1.  Hasil Pengamatan Isolasi DNA

Foto Hasil Pengamatan	Keterangan
	Setelah sentrifuge kedua dengan kecepatan 14000rpm selama 10 menit.            Warna merah muda               Sampel di homogenkan dengan cara dibolak-balik sebanyak 50x
	Setelah di sentrifuge dengan kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit       Larutan Bening         DNA

Tabel 2.  Pengamatan Hasil Elektroforensis DNA

Foto Hasil Pengamatan	Keterangan
	Tambahkan loading dye kedalam sampel dengan perbandingan 5 bagian sampel DNA dan 2 bagian Loading dye.
	Sampel dimasukkan ke dalam sumur yang terdapat dalam gel, alat siap dipasang dan disambungkan ke sumber listrik( elektroforesis pada daya  100 volt selama 30 menit )
	Fragmen DNA yg sempurna, karena tidak  terurai          Kontrol fragmen-fragmen DNA              Fragmen DNA yang banyak terurai dan kurang sempurna

PERTANYAAN DAN JAWABAN

Isolasi DNA

1. Hitung jumlah senyawa yang dimasukka pada tahapan kerja nomer 5, 14 dan 18!

Buffer ekstraksi sebanyak 4 kali volume total sampel = 4 x

Kloroform Isoamil Alkohol sebanyak ½ x volume total sampel = ½ x

Alkohol sebanyak 2 x volume total sampel = 2 x

2. Jelaskan apa fungsi senyawa-senyawa yang digunakan dalam isolasi DNA !

Buffer ekstraksi berperan dalam proses destruksi jaringan tanaman sehingga terjadi degradasi pada DNA.

SDS berfungsi sebagai detergen yang dapat melisis dinding sel dan mendenaturasi protein.

Kloroform Isoamil Alkohol membantu proses denaturasi protein yang masih menempel pada kromosom.

Alkohol digunakan untuk mempresipitasi asam nukleat.

Elektroforesis DNA

1. Coba sebutkan manakah yang disebut DNA pada hasil elektroforesis anda !
2.  

      2. Mengapa DNA hanya dapat diamati dengan bantuan sinar UV ? Jelaskan !

DNA berukuran sangat kecil dan sulit untuk diamati, oleh karena itu untuk memudahkan pengamatan DNA diwarnai menggunakan Etidium bromida. Etidium bromida ini akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan baru akan tampak jika di bawah lampu UV, warnanya ’orange fluoresence’.

3. Apakah Etidium Bromide ? Bagaimana cara kerja Etidium bromida dalam proses pewarnaan DNA ?

Etidium bromida seperti telah disebutkan di atas adalah pewarna yang digunakan untuk mempermudah pengamatan DNA dalam gel. Etidium bromida akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan baru akan tampak jika di bawah lampu UV, warnanya ’orange fluoresence’.

BAB III

PEMBAHASAN

Isolasi DNA

Pada praktikum isolasi DNA, dilakukan isolasi terhadap tanaman strawberry. Isolasi DNA ini dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan dengan mengambil beberapa bagian dagiang buah strawberry yang dihancurkan didalam tabung. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis, yaitu menggunakan larutan buffer ekstraksi.

Untuk mengisolasi jaringan buah strawberry, maka jaringan tanaman tersebut yang masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke dalam tabung diberikan larutan pelisis sel yaitu buffer ekstraksi seperti yang dipaparkan di atas yang merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis. Larutan pelisis sel terdiri atas EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate) dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Selain itu dalam larutan tersebut juga terdapat larutan NaCL yang berfungsi untuk menstabilkan larutan sehingga mempercepat reaksi-raksi yang akan terjadi pada tahapan berikutnya.

Untuk melisiskan membran sel dan membran nukleus sel tanaman yang terisolasi tadi, diberikan pula larutan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) yang berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur. Pada saat proses destruksi jaringan tanaman dapat menyebabkan degradasi pada DNA dengan adanya aktivitas enzim endonuklease, karena itu digunakan buffer ekstraksi yang mengandung senyawa Tris, EDTA, CTAB, potassium asetat, dan SDS. Senyawa CTAB dan SDS merupakan detergen, yang dapat melisis dinding sel dan mendenaturasi protein. Selain itu CTAB dan EDTA adalah senyawa inhibitor yang dapat menghambat aktivitas enzim nuclease. Kemudian sampel tersebut dihomogenkan dengan menggunakan vortekx. Setelah dihomogenkan warna larutan berubah menjadi merah.

Sampel yang telah homogen kemudian diinkubasikan, setelah itu diberi larutan Potassium asetat dan dihomogenkan, setelah homogeny sampel disimpan dalam wadah berisi es. Potassium asetat adalah senyawa yang berikatan dengan debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-potassium aesta-protein- debris sel. Setelah itu sampel disentrifuga pada kecepatan 14.000 rpm selam 10 menit.

Setelah sampel disentrifuga terbentuk 2 lapisan, fasa atas berupa larutan ekstrak dan berwarna bening, sedangkan fasa bawah berupa endapan yang berwarna merah.  Fasa atas yang kemudian diambil untuk digunkan pada tahap selanjutnya. Tahap ini disebut juga dengan tahap purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan sel tanaman dari zat-zat lainnya.

Kemudian, pada tahap berikutnya digunakan klorofom: isoamil alcohol (24:1) yang berperan untuk mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom, sedangkan untuk mempresipitasi asam nukleat digunakan alkohol 100%. Pemberian alkohol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. DNA dalam alcohol akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan DNA dalam air akan larut, tetapi protein tidak dapat larut dalam air. Tahap tersebut merupakan terakhir, disebut juga tahap presipitasi presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Hal tersebut dapat terlihat dengan adanya benang-benang endapan DNA pada dasar tabung.

 Pembahasan Elektroforesis

            \Pada praktikum elektroforesis kali ini digunakan gel agarose karena dengan menggunakan gel agarose teknik yang digunakanpun cukup sederhana, mudah penanganannya dan sederhana, selain itu gel agarose mempunyai kemampuan pemisahan dengan range yang cukup luas yaitu mulai 70 pb (pasangan basa) sampai 800.000pb.

            Selainitu penggunaan gel agarose juga mempunyai keuntungan, dimana lokasi dari DNA dalam gel dapat diamati secara insitu dengan menggunakan Etidium Bromida sebagai pewarna. Etidium bromide nantinya akan berinteraksi dengan basa dari molekuk DNA dan memberikan warna orange Floresance dibawah lampu UV.

            Hasil penyinaran dibawah lampu UV dapat dilihat berupa potongan pita-pita DNA, yang mempunyai fragmen-fragmen.Gambar pada hasil pengamatan kami ditemukan salah satunya potongan fragmen pita DNA yang banyak terurai dan kurang sempurna karena pengaruh konsentrasi agarose yang menyebabkan DNA bermigrasi,sehingga fragmen-fragmennya lebih besar.

Bab IV

Kesimpulan

DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan. Pada praktikum isolasi DNA dari tanaman digunakan jaringan tanaman yang mengandung sedikit kontaminan, yaitu menggunakan daging buah. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu isolasi jaringan, dinding dan membran sel dilisiskan, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi.

Dari hasil pengamatan dapat dilihat hasil dari tahap-tahap yang telah dilakukan. Isolasi DNA telah berhasil dilakukan. Hal tersebut dilihat dengan adanya benang-benang DNA yang terbentuk. Terbentuknya benang-benang tersebuut juga merupakan hasil dari proses tahapan-tahapan yang dilakukan dengan menggunakan larutan senyawa-senya tertentu.

                                                                               

DAFTAR PUSTAKA

Achmmad, Wendy. 2010. Isolasi DNA.

http://www.macnature.com/2010/02/isolasi-dna-referensi-terpercaya.html

http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_extraction )

http://kirsman83.weebl..com/2/post/2010/01/isolasi-dna buah.htmly.com/2/post/2010/01/isolasi-dna-buah.html

http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis (diakses pada tanggal 10 Mei 2010)

Lampiran Gambar

Proses Penuangan larutan ke dalam sampel dengan menggunakan mikropipet
Sentrifuge
Pipet Ukur